Genomics & Transcriptomics Facility
Einleitung
In der Genomics & Transcriptomics Facility (GTF) werden Next Generation Sequencing und speziell Einzelzell-Sequenzierungen für die Institute und Kliniken der hiesigen Medizinischen Fakultät, der Universität Duisburg-Essen und andere Einrichtungen außerhalb Essens im Rahmen verschiedener Kooperationsvorhaben durchgeführt und analysiert, um eine breite Anwendung in der Grundlagenforschung und in klinischen Studien zu ermöglichen. Mit Hilfe der (bulk) RNA-Sequenzierung ist es möglich, die Expression von Genen (mRNA, aber auch total RNA, smallRNA, lncRNA) zu messen und so im Idealfall die transkriptionelle Aktivität einer Zelle in verschiedenen physiologischen Zuständen zu analysieren und zu vergleichen.
Typische Anwendungen der DNA-Sequenzierung sind die Exom- und die Whole Genome-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen in Tumoren sowie die TCR/BCR-Sequenzierung für T-Zell und B-Zell Analysen und die Bisulfit-Sequenzierung zur genomweiten Analyse der DNA-Methylierung.
Dr. rer. nat.
Bettina Budeus
Team
Adriane Hyla
Olga Kruse
Dr. rer. nat.
René Scholtysik
Sabine Senkel
Forschungsprogramm
Überblick
In der Genomics & Transcriptomics Facility (GTF) werden Next Generation Sequencing und als Spezialfall Einzelzell-Sequenzierungen für die Institute und Kliniken der hiesigen Medizinischen Fakultät, der Universität Duisburg-Essen und andere Einrichtungen außerhalb Essens im Rahmen verschiedener Kooperationsvorhaben durchgeführt und analysiert, um eine breite Anwendung in der Grundlagenforschung und in klinischen Studien zu ermöglichen.
Mit Hilfe der Next Generation Sequenzierung können durch massive Parallelisierung Gigabasen in einem Lauf sequenziert werden. Typische Anwendungen sind die Exom- und die Whole Genome-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen in Tumoren sowie die RNA-Sequenzierung und die Bisulfit-Sequenzierung zur genomweiten Analyse der DNA-Methylierung. Einzelzell-Sequenzierungen basieren auf demselben Hintergrund (oftmals RNA-Sequenzierung), jedoch gewinnt man Erkenntnisse über einzelne Zellen, welches eine Analyse von Subtypen ermöglicht.
Außerdem bietet die GTF auch Beratungen für oben genannte Experimente (wie viele Proben brauche ich?, wie isoliere ich die RNA richtig? etc.), sowie Unterstützung bei der Fördermittelaquise für NGS Projekte an.
Next Generation Sequenzierung
An der Genomics & Transcriptomics Facility (GTF) steht ein Illumina MiSeq für die massiv parallele Sequenzierung in einer sogenannte Flowcell zur Verfügung. Neben dem eigentlichen Gerät für die Sequenzierung steht eine Plattform (Caliper ScicloneG3) für die automatisierte Herstellung und Reinigung von Sequenz-Bibliotheken (Libraries) zur Verfügung. Außerdem kooperiert die GTF mit anderen Laboren in Essen, aber auch an anderen Standorten (Düsseldorf, Heidelberg), um auch größere Projekte auf anderen Illumina-Geräten sequenzieren zu können (NextSeq500, NextSeq2000 und Novaseq).
Für die Erstellung von Einzelzellen Libraries steht ein Chromium Controller von 10X Genomics, sowie ein Rhapsody von BD plus Scanner zur Verfügung. Damit können je nach Bedarf RNAseq, aber auch ATACseq, Surface-marker oder B/T-Cell Repertoire einzeln oder kombiniert analysiert werden. Der Chromium Controller arbeitet mit einem Droplet-basierten System, der Rhapsody mit einem Well-basierten System.
Außerdem steht ein besonderer Zellsortierer von Miltenyi zur Verfügung mit dem Zellen besonders schonend sortiert werden können, was für die Analyse von Einzelzellen wichtig sein kann.
Folgende Anwendungen werden von der GTF angeboten:
- RNA-Sequenzierung mit Lexogen QuantSeq, Tecan Revelo, Illumina TruSeq
- SingleCell Sequenzierungen mit 10X Genomics
- SingleCell Sequenzierungen mit BD Rhapsody
- Whole Genome Sequenzierung mit NEB Next Ultra II, Illumina TruSeq oder Nextera Kits
- Exom- und Custom-Anreicherung mit Hilfe von Agilent SureSelect XT Exome/Choice Kits
- Re-Sequenzierung mit Hilfe des NuGEN Target Enrichment Systems
- Whole Genome Bisulfit-Sequenzierung
- Schonende Zellsortierung mittels MACSQuant Tyto
- Spezial-Anwendungen und -Auswertungen, inklusive Etablierungs- und Testläufen
Die Genomics & Transcriptomics Facility (GTF) führt von der Qualitätskontrolle der RNA/DNA mittels Agilent Bioanalyzer über die Herstellung der Libraries (bulk- oder einzelzellbasiert) bis zur Sequenzierung alle Schritte für Sie durch.
Wir sequenzieren aber auch vom Kooperationspartner produzierte Illumina-kompatible Libraries (z.B. für die ChIP-Sequenzierung).
Für die Auswertung der Daten steht ein Server mit entsprechender Rechen- und Speicherkapazität zur Verfügung.
Umfangreichere Analysen können jedoch eine Kooperation mit der hiesigen Genominformatik und/oder einem entsprechenden externen Partner erforderlich machen. Die Details können vorab in einem Gespräch mit dem Leiter der GTF besprochen werden.
Für einen reibungslosen Ablauf sollte möglichst frühzeitig in der Planung ein Projekt angemeldet werden, alleine schon um möglichen Fehlern (z.B. zu wenig biologische Replikate) im experimentellen Design vorzubeugen.
Projektablauf
Beispiel eines Projektablaufs:
- Das Projekt wird angemeldet und mit der Leitung der GTF im Vorfeld durchgesprochen
- Sobald die Proben (isolierte RNA, DNA oder Zellsuspensionen für die Einzelzellanalyse/Sortierer) zur Verfüng stehen, können uns diese zusammen mit einer detailierten Beschreibung (z.B. Mengenangaben und Konzentrationsbestimmung mittels Nanodrop) übergeben werden
- Zunächst machen wir von allen Proben eine Qualitätskontrolle, deren Ergebnisse wir mit dem Kunde absprechen (z.B. die Entfernung von Proben mit schlechter Qualität)
- Mit den dann abgesprochenen Proben wird das Projekt durchgeführt (z.B. Library erstellt) und sequenziert
- Die Sequenzierdaten können nach der Sequenzierung abgeholt werden, im Falle von bulk RNAseq (nicht Einzelzell-basiert) bieten wir auch an, die Analyse der Daten durchzuführen
Für Kunden des UK Essen ist zwecks Abrechnung die Angabe einer Hauskostenstelle (beginnt mit einer 9) nötig.
